Die Geschichte ist die Brücke zwischen Assassin's Creed II und Assassin's Creed Brotherhood. Nach der Zerstörung von Monteriggioni im Jahr 1500 traf sich Ezio mit Leonardo Da Vinci, um Informationen über den Sohn des Papstes, Cesare Borgia, zu sammeln. Leonardo erzählt Ezio von Cesares Aufstieg an die Macht.